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Sedlin突變體的表達及其與RB1在細胞中的共定位
關鍵詞：突變體 質粒構建 蛋白表達 免疫熒光
摘要：目的構建脊椎骨骺發育不良蛋白(Sedlin)的缺失突變和點突變體質粒,檢測其在細胞內的表達、定位及其與RB1蛋白的共定位情況,為后續研究蛋白質相互作用提供依據。方法以Sedlin全長cDNA序列為模板,擴增目的基因序列,連接至表達載體,構建3個原核表達質粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相應的真核表達質粒,即pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F。分別轉化pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F到大腸桿菌BL21感受態細胞中,IPTG誘導表達、谷胱甘肽瓊脂糖球珠純化后進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色法檢測其表達情況;分別轉染pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F于HEK 293T細胞,Western blot法檢測相關蛋白在真核細胞中的表達情況;分別單轉pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F以及將上述質粒與pDNA3.1-FLAG-RB1共轉到COS7細胞中,進行免疫熒光制片,觀察其在真核細胞內的定位情況。結果測序結果顯示pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F重組質粒構建成功;考馬斯亮藍染色顯示融合蛋白GST-SedlinN/Y115A/Y115F在BL21細胞中能夠大量表達;Western blot結果顯示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F在HEK 293T細胞中能夠高效表達;免疫熒光結果顯示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F蛋白在COS7細胞的細胞質和細胞核中均有分布,并與RB1蛋白存在明顯的核內共定位。結論人Sedlin及其突變體在BL21菌株和HEK 293T細胞中均能有效表達;在COS7細胞中,Sedlin主要表達于細胞核,而Sedlin突變體除在細胞核中表達外,在細胞質中也有相當量的表達,Sedlin及其突變體均與RB1蛋白共定位,顯示Sedlin羧基端以及NPFY基序中的Y磷酸化與否并不影響與RB1蛋白的共定位。
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